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上海中医药大学:基于网药、分子对接与实验验证揭示薯蓣皂苷元治疗动脉粥样硬化的作用机制bob.com

时间:2023-01-23 00:33:18 点击次数:

  动脉粥样硬化( atherosclerosis , AS )是一种发生在大中动脉内膜层的慢性炎症性疾病 [1] 。脂质代谢失衡是最初的公认原因,后来研究发现炎症过程贯穿 AS 的始终。近年来,研究者逐渐认识到先天性和适应性免疫机制在 AS 进程中的重要作用 [2] 。 AS 晚期斑块常造成血管狭窄、不稳定斑块破裂以及血栓形成,引起血管闭塞,导致致命的心血管疾病,这也成为老年人死亡最常见的原因之一 [3] 。目前临床治疗主要集中于降低低密度脂蛋白胆固醇水平和对并发症进行治疗。尽管目前抗胆固醇合成药物中的他汀类药物及抗血小板药物在 AS 的防治中起到了积极的作用,但临床应用中也发现了许多不良反应,例如他汀类药物可引起肌炎、肌痛 [4] ,因此有必要开发更多替代药物以扩充临床用药选择。

  中药以及从中药中提取的天然化合物由于其高治疗价值、低全身毒性和广泛的药理活性而受到越来越多的关注。薯蓣皂苷元是一种来源于薯蓣属植物(如盾叶薯蓣、黄山药)的天然甾体皂苷元 [5] ,是地奥心血康、盾叶冠心宁的主要活性成分。地奥心血康、盾叶冠心宁主要用于治疗冠心病、心绞痛、高脂血症等。薯蓣皂苷元与胆固醇具有类似的化学结构,在肠道中可竞争性地抑制膳食胆固醇吸收 [6-7] 、 调节脂质代谢 [8-9] 、改善高胆固醇血症 [10-11] ,同时还具有抗氧化 [12] 、抗炎 [13] 、抗增殖 [14] 等药理作用,因此有望成为一种新型抗 AS 药物。然而,目前关于薯蓣皂苷元在 AS 中研究仍处于初级阶段,其潜在靶点及药理学作用机制有待进一步研究。

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  网络药理学是一种基于系统生物学发展起来的,与高通量筛选、下一代测序、多组学应用相关的新型药物研究范式 [15] 。其打破了传统的“一种疾病 - 一个靶点 - 一种药物”的思维范式,通过多靶点、多途径的方式阐述复杂疾病的发病机制 [16-17] 。对于多靶点的天然产物未知药理学作用的探索具有积极的预测作用。目前尚无薯蓣皂苷元抗 AS 的网络药理学相关研究,因此本研究拟通过网络药理学和分子对接技术预测薯蓣皂苷元与潜在靶标之间的相关性,并通过体外实验对相关靶点和通路进行验证,以期为薯蓣皂苷元抗 AS 的机制研究提供新思路。

  人单核 THP-1 细胞(批号 20210723A1 )购自大连美仑生物科技有限公司。

  Eclipse E100 型正置光学显微镜(日本尼康公司); DENLEY DRAGON Wellscan MK 型酶标仪、 BB5060 型 CO2 培养箱(美国 Thermo Fisher Scientific 公司); PYX-DHS 型数字显示隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂); TGL-168 型离心机(上海安亭科学仪器厂);蛋白电泳系统(美国 Bio-Rad 公司); XW-80A 型漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂); ChemiScope 系列荧光及化学发光成像系统(勤翔科学仪器有限公司); 1200 型高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司)。

  2.1.3 蛋白质 - 蛋白质相互作用( protein-protein interaction , PPI )网络构建 通过 Venny2.1.0 ( )绘制韦恩图,筛选出薯蓣皂苷元和 AS 共同靶点。将这些靶点上传到 STRING 数据库( )中生成 PPI 网络 [25] ,将条件设置为“ human ”,置信度设置为最高置信度(得分值> 0.9 )并隐藏网络中断开连接的节点,将得到的 PPI 网络保存为 TSV 文件,导入 Cytoscape 3.7.2 软件构建和可视化靶网,并通过设定度值大于平均值筛选出核心靶点 [26] 。

  2.2.3油红 O 染色评估泡沫细胞形成 将 2 mL THP-1 细胞以 1 × 106 个 /mL 接种于 6 孔板中,按“ 2.2.1 ”项下方法诱导泡沫细胞形成,并给予药物干预 48 h 后,将细胞于 4% 多聚甲醛中固定 10 min ,用 60% 异丙醇漂洗 15 s ;用油红 O 染液染色 15 min ,用 60% 异丙醇洗涤 10 s ;用苏木精复染细胞 1 min ,用 PBS 洗涤 3 次后,在倒置显微镜下对阳性染色的细胞(红色)进行拍照,使用 Image-Pro Plus 6.0 软件分析油红染色中脂滴与整个图像面积的面积比进行定量。

  2.2.5ELISA 检测细胞上清液中炎性细胞因子水平 按“ 2.2.3 ”项下方法处理细胞并给药后,收集细胞上清液,按照 ELISA 试剂盒说明书测定上清液中 IL-1β 、 TNF-α 和 IL-6 水平。

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  2.2.7统计分析 使用GraphPad Prism 7.2 软件进行统计分析,数据以 表示,使用单因素方差分析进行多组间比较。

  通过 Omicshare 网站获得 275 个薯蓣皂苷元与 AS 的交叉靶点(图 1 ),将这 275 个靶点导入 String 数据库,将生成的 PPI 网络导入 Cytoscape 软件,计算所有节点的拓扑特征并进行可视化。移除 PPI 网络中与主要网络离散且边缘较少的节点后,最终呈现 191 个靶点、 604 条边。根据度值≥ 6.324 6 ,鉴定出包括 src、 STAT3 在内的 52 个关键靶点,如图 2 所示,颜色越红,面积越大代表度值越高, 52 个关键靶点分别位于圆圈中心 2 层。

  对 191 个靶点进行 GO 功能和 KEGG 通路富集分析,共富集出 198 条分子功能、 1818 条生物学过程、 111 条细胞成分。图 3 列出了前 20 个 BP 、 MF 、 CC 条目( P < 0.01 ),结果表明薯蓣皂苷元对 AS 的潜在靶点与蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、核受体活性等分子功能有关,与蛋白质磷酸化、细胞对脂质的反应、细胞迁移的正向调节等生物学过程有关,与受体复合物、细胞体、膜筏等细胞成分有关。图 4 列出了前 20 条 KEGG 信号通路,去除不相关的广谱通路, KEGG 富集分析显示主要涉及脂质与动脉粥样硬化途径、钙信号通路、核因子 -κB ( nuclear factor-κB , NF-κB )信号通路等通路。表明薯蓣皂苷元可能通过调节脂质代谢和炎症对 AS 发挥作用。其中,脂质与动脉粥样硬化途径是一个包含 27 个靶基因的重要途径,涵盖了包括 src、 STAT3 等众多靶基因(图 5 ),因此基于 Src/STAT3 通路进行后续研究。

  如图 6 所示,薯蓣皂苷元和 src的残基 LYSA : 298 氢键结合有助于结构的稳定,其次薯蓣皂苷元和 src间形成 alkyl 键、 Pi-alkyl 键和范德华力作用。薯蓣皂苷元和 STAT3 的残基 ASPA : 334 氢键结合有助于结构的稳定,其次薯蓣皂苷元和 STAT3 间也形成 alkyl 键、 Pi-alkyl 键和范德华力作用。薯蓣皂苷元与 src、 STAT3 的相互作用能分别为 −34.31 、 −34.73 kJ/mol ,均小于 −20.92 kJ/mol ,表明薯蓣皂苷元与 2 个靶点之间具有良好的结合亲和力。

  3.5.1薯蓣皂苷元对巨噬细胞活力的影响 如图 7 所示,当薯蓣皂苷元浓度低于 20 μmol/L 时,对细胞活性无显著影响;当薯蓣皂苷元浓度高于 20 μmol/L 时,呈剂量相关性地抑制细胞活力( P < 0.01 、 0.001 ),因此以 0.1 、 1.0 、 10.0 μmol/L 作为薯蓣皂苷元的低、中、高剂量进行后续实验。

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  3.5.2薯蓣皂苷元对泡沫细胞形成的影响 如图 8 所示,与对照组比较, ox-LDL 负载显著增加脂滴染色( P < 0.001 ),表明泡沫细胞诱导成功;与模型组比较,薯蓣皂苷元中、高剂量组和阿托伐他汀组显著抑制泡沫细胞中脂质的积累( P < 0.001 )。

  3.5.3薯蓣皂苷元对 THP-1 巨噬细胞衍生的泡沫细胞 TC 、 FC 和 CE 水平的影响 如表 1 所示,与对照组比较,模型组 TC 、 FC 和 CE 水平均显著升高( P < 0.01 );与模型组比较,各给药组 TC 和 CE 水平均显著降低( P < 0.05 、 0.01 ),薯蓣皂苷元中、高剂量组和阿托伐他汀组 FC 水平均显著降低( P < 0.05 、 0.01 )。

  3.5.4薯蓣皂苷元对 THP-1 巨噬细胞衍生泡沫细胞上清液中促炎细胞因子水平的影响 如图 9 所示,与对照组比较,模型组细胞上清液中 IL-6 、 IL-1β 和 TNF-α 水平均显著升高( P < 0.001 );与模型组比较,各给药组细胞上清液中 TNF-α 水平显著降低( P < 0.001 ),薯蓣皂苷元中、高剂量组和阿托伐他汀组细胞上清液中 IL-6 和 IL-1β 水平均显著降低( P < 0.05 、 0.01 、 0.001 )。

  3.5.5薯蓣皂苷元对 THP-1 巨噬细胞衍生泡沫细胞中 Src/STAT3 信号通路相关蛋白表达的影响 src是 STAT3 信号传导的重要调节剂 [30] , src激活可触发 STAT3 活性 [31] 。此外, ox-LDL 可显著上调大鼠胸主动脉平滑肌 VSMC 细胞中 src磷酸化水平,而沉默 src可显著逆转这一效应 [32] 。如图 10 所示,与对照组比较,模型组 src和 STAT3 的磷酸化水平均显著升高( P < 0.001 );与模型组比较,各给药组 src和 STAT3 的磷酸化水平均显著降低( P < 0.05 、 0.01 、 0.001 )。因此,薯蓣皂苷元可能通过抑制 Src/STAT3 信号通路,减轻脂质代谢和促炎细胞因子的分泌,进而改善 AS 。

  AS 是造成急性冠脉综合征、脑卒中等心脑血管疾病的关键病理基础。薯蓣属植物作为一种药食同源的植物,其毒性极低,产量丰富,价格低廉,并且含有丰富的甾体皂苷,这些甾体皂苷经提取已被制成多种心血管病临床药物。薯蓣皂苷元作为盾叶冠心宁、地奥心血康的最主要的活性成分之一,具有广泛的临床应用价值。薯蓣皂苷元在多种慢性病中发挥重要作用 [33] 。研究发现,薯蓣皂苷元可以抑制 AS 小鼠疾病进展 [34] ,降低高脂饮食喂养大鼠血清中 TC 、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇水平,下调 NF-κB 表达,减轻炎症反应 [35] 。薯蓣皂苷元抗 AS 的作用机制尚未被全面揭示。

  近年来,网络药理学的兴起无疑为多靶点疾病机制的探讨以及多靶点药物药理作用的探讨提供了一种新的分析工具 [36-37] 。本研究通过公开数据库筛选了薯蓣皂苷元和 AS 共同靶点,并构建 PPI 网络以获得核心靶点。通过 GO 功能和 KEGG 通路富集分析探讨薯蓣皂苷元抗 AS 的作用机制。 KEGG 分析结果中涉及癌症通路、癌症中的转录失调、甲状腺癌等癌症相关信号通路,推测 src、 STAT3 、丝裂原活化蛋白激酶 3 ( mitogen-activated protein kinase 3 , MAPK3 )、蛋白激酶 B1 ( protein kinase B1 , AKT1 )等多个靶点共同参与癌症与 AS 相关信号通路,并在发病机制上显示出一些相似性,如抑制细胞的增殖与迁移、抑制血管新生、抑制炎症等。在剔除不相关的信号通路后,发现薯蓣皂苷元抗 AS 主要与脂质代谢和炎症相关,涉及脂质与动脉粥样硬化途径、 Janus 激酶( Janus kinase , JAK ) -STAT 信号通路、 NF-κB 信号通路等。此外, GO 功能分析表明了薯蓣皂苷元抗 AS 涉及蛋白质磷酸化、细胞对脂质的反应、细胞迁移的正向调节、炎症反应、细胞黏附的调节、上皮细胞增殖的调节、细胞群增殖的负调控、细胞死亡等生物学过程。提示薯蓣皂苷元可能在脂质代谢、炎症、上皮细胞与血管平滑肌细胞的增殖与迁移、巨噬细胞的迁移与黏附、血管生成、细胞凋亡等 AS 病理环节中发挥重要作用。在筛选的 52 个核心靶点中, src与 STAT3 度值最高,同时富集出现在脂质和动脉粥样硬化通路、黏附连接、凋亡、炎症相关信号通路、 JAK-STAT 信号通路等 9 条通路中,并且 src处于 STAT3 上游。 src激活可触发 STAT3 活性,促进磷酸化 STAT3 表达 [30] 。分子对接结果也表明 src、 STAT3 与薯蓣皂苷元具有较高的结合亲和力。

  Src 是一种与迁移相关的非受体酪氨酸激酶,抑制 src信号通路可抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移 [38-39] 。 src在调节巨噬细胞功能中发挥重要作用,尤其是巨噬细胞介导的炎症反应和免疫反应。巨噬细胞的黏附迁移和炎症作为 AS 的重要环节,而 src参与调节所有 Toll 样受体( Toll-like receptor , TLR )家族成员介导的炎症信号通路,表明 src在 AS 巨噬细胞炎症中发挥潜在作用 [40] 。此外, src的激活提供了初始炎症信号,触发了 NF-κB 介导的炎症途径, NF-κB 可刺激 IL-6 表达, IL-6 的激活又可促进 STAT3 的激活,以响应炎症信号 [41] 。 在巨噬细胞脂质代谢中, src活性的抑制可减轻巨噬细胞脂质积累 [42] 。 src家族激酶还通过参与解整合素 - 金属蛋白酶 15 ( a disintegrin and metalloproteinase 15 , ADAM15 )诱导的内皮屏障功能障碍,减轻 AS[43] 。在肿瘤研究中发现,抑制 src可以抑制 STAT3 的激活 [44] 。薯蓣皂苷可通过抑制 Src/STAT3 信号通路减少血管生成,在抑制黑色素瘤的生长中发挥重要作用 [45] 。薯蓣皂苷是薯蓣皂苷元的糖苷形式,两者具有相似的效应,推测薯蓣皂苷元对 Src/STAT3 信号通路也有积极的调控作用。

  STAT3 是一种重要的核转录因子,在 AS 过程中参与内皮功能障碍、脂质代谢、巨噬细胞极化、炎症调节、血管平滑肌增殖与迁移 [46] 。 STAT3 抑制剂可抑制 ox-LDL 诱导的巨噬细胞脂质积累,减轻巨噬细胞炎症反应 [47] 。在体内和体外实验中,抑制 JAK2/STAT3 通路可降低巨噬细胞内三酰甘油、 TC 和低密度脂蛋白胆固醇水平 [48] ,抑制血管平滑肌细胞增殖,减轻颈动脉内膜厚度 [49] 。 STAT3 在不稳定斑块中可能也发挥重要作用,抑制 STAT3 可能通过抑制内皮细胞的增殖和迁移,减少血管生成,延缓不稳定斑块的进展 [50] 。本研究通过体外诱导泡沫细胞模拟 AS 斑块中泡沫细胞的形成过程,探索薯蓣皂苷元抗 AS 的作用机制,结果显示,薯蓣皂苷元可显著降低 ox-LDL 诱导的巨噬细胞脂质堆积,表现为泡沫细胞脂滴明显减少, TC 、 CE 和 FC 水平降低,同时炎症因子 IL-1β 、 IL-6 和 TNF-α 水平也显著降低;此外,薯蓣皂苷元可抑制 src和 STAT3 的磷酸化水平,表明薯蓣皂苷元可能通过抑制 Src/STAT3 信号通路,抑制巨噬细胞脂质堆积和促炎因子表达,改善 AS 。

  本研究通过网络药理学结合分子对接和体外实验验证,探讨了薯蓣皂苷元治疗 AS 的作用机制。薯蓣皂苷元参与调节多条与 AS 相关的通路,涵盖众多靶点和细胞成分。薯蓣皂苷元可减轻巨噬细胞炎症及脂质堆积,这一效应可能与抑制 Src/STAT3 信号通路有关。本研究拓展了薯蓣皂苷元抗 AS 的机制,为 AS 的治疗和新药研发提供了一种思路。

  来 源:王 丹,王肖龙.基于网络药理学、分子对接与实验验证揭示薯蓣皂苷元治疗动脉粥样硬化的作用机制 [J]. 中草药, 2022, 53(24):7783-7794.

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